紐約市下水道中，四只小海龜與一只小老鼠因接觸放射性凝膠變異為巨型人化生物。在東方武術大師斯普林特（配音：詹姆斯·艾弗里）的指導下，四兄弟成長為忍者戰士——暴躁卻熱血的拉斐爾（喬什·帕斯飾）、幽默的米開朗基羅（邁克林·西提飾）、沉穩的多納泰羅（利夫·蒂爾登飾）與領袖達芬奇（大衛·福爾曼飾）。他們多次打擊犯罪后，招致克朗集團的報復。該組織由面具人施萊德領導，利用高科技武器對忍者神龜發起突襲。寡不敵眾的戰斗中四兄弟身受重傷，斯普林特亦遭擒獲。被囚禁的老師揭露克朗企圖用生化武器控制城市的陰謀后，恢復元氣的忍者們潛入敵方總部展開營救。最終在中央公園鐘樓決戰中，達芬奇以雙截棍擊潰施萊德的機械戰甲，四兄弟合力粉碎克朗的征服計劃。